Margareta Leijonhufvud föddes år 1516 som dotter till riksrådet Erik Abrahamsson Leijonhufvud och Ebba Eriksdotter Vasa. Hennes familj tillhörde Leijonhufvud och kom tidigt att spela en central roll i den svenska makteliten under tidigt 1500-tal.

Den 1 oktober 1536 gifte sig Margareta med kung Gustav Vasa på Väsby slöts eller i Uppsala. Äktenskapet ingicks i en tid av politisk konsolidering efter Gustav Vasas maktövertagande och skapade starka band mellan kungen och den inhemska högadeln.

Som Sveriges drottning kom Margareta att utöva ett betydande inflytande, även om källorna till stor del skildrar henne genom makens och tidens officiella handlingar. Hon födde ett stort antal barn, var av flera kom att bli regenter eller centrala gestalter i svensk historia, däribland kungarna Johan III, Karl IX och Erik XIV.

Drottning Margareta beskrivs i samtida källor som djupt troende och gästfri. Hon gynnade kyrkliga institutioner och stod i nära förbindelse med Vadstena kloster, som vid denna tid påverkades av reformationens omvälvningar i riket.

Under sitt sista levnadsår drabbades hon upprepade gånger av sjukdom, delvis till följd av sina många barnbörder. Hon avled på Tynnelsö slott i augusti 1551, endast 34 år gammal, och begravdes i Uppsala domkyrka.